Agarose

Electrophoresis 12 11 10 9 8 7 6 5 4 2 1 3 Λ DNA was digested with the restriction enzyme (EcoR1/BamH1/Sac1/Sma1), following the manufacturers’ specified experimental conditions. The samples were then loaded in the above order onto 0.8% agarose gel, made up in an electrophoresis TBE buffer (composition, 89mM Tris, 89mM boric acid, 2mM EDTA). The electrophoresis was performed at 120 volts for 1.25 hours. The gel was then stained with ethidium bromide for 20 minutes and then visualised in

support de l'électrophorèse est fonction de la taille moyenne des fragments à séparer. | % acrylamide | Taille des fragments à séparer(paires de bases ou nucléotides) | 4 | 200 à 800 | 5 | 80 à 200 | 8 | 40 à 100 | 11 | 10 à 50 |   % agarose | Taille des fragments à séparer(en Kb) | 0,6 à 0,8 | 1 à 20 | 0,9 à 1,2 | 0,5 à 7 | 1,2 à 1,5 | 0,2 à 5 | |     -Le gel de polyacrylamide: il est utilisé pour la séparation de petits fragments, c'est à dire moins de 1 000 paires de bases

Les protéines sont séparées en fonction de leur masse molaire par électrophorèse en présence de SDS sur gel de polyacrylamide de concentration uniforme dans un système à cuves verticales. • Methodologie : La Préparation du gel D’agarose à 1% : (1g agarose/ 100ml TBE ). TBE: tampon d’éléctrophorèse(Tris-borate-EDTA) Utilisé pour la migration éléctrophorique toujours à 1X . La solution initiale de TBE est à 10X on fait un simple calcul C1.V1 = C2.V2 Après avoir mis tous les ingrédients chauffer la

(plasmide pBluescript) Digestion 18 4- Visualisation des fragments de restriction (électrophorèse) 19 An Introduction to Genetic Analysis Visualisation des fragments d’ADN (électrophorèse) L’ADN à une charge négative !!!! Gel agarose Banc UV Bromure d’ethidium Quoi espérer ? Photo 20 5- Étape de Ligation Au cours de cette étape on va produire l’ADN recombinant LIGASE - 2µl plasmide pBluescript - 2µl d’ADN du phage - 10 µl tampon X2 - 3µl d'eau - 2µl de tampon de

distingue trois grands types d’agars se différenciant par leur proportion en radicaux hydrophobes CH2-O et hydrophiles OSO₃-, qui influence la qualité du gel :  - Le type « agarose » est caractérisé par de nombreux radicaux hydrophobes et peu de radicaux hydrophiles. Le gel obtenu sera de très haute qualité.   - Le type « agarose chargé » possèdent moins de radicaux hydrophobes et plus de radicaux hydrophiles que les précédents. Les radicaux hydrophiles tentent de s’opposer au rapprochement des molécules

1L 3- Placer dans le puits central 20µl anti-IgG humain (0.5 ou 1 mg/ml) 4- Mettre les boîtes à incuber à température ambiante dans une enceinte légèrement humidifiée par du papier filtre mouillées au PBS ou a l’eau pour éviter que le gélose ou agarose devient sec. 5- Les résultats peuvent être lus 24 h plus tard. 6- Rincer la plaque trois fois avec de l'eau distillée et les sécher 7. Coloration du gel: Il est possible de colorer les arcs de précipitation par le bleu de Coomassie (colorant les proteines)

Digestion d’ADN par des enzymes de restriction 18 Polymerase Chain Reaction (PCR) 20 Electrophorèse d’ADN en gel d’agarose 21 Culture de bactéries E. coli 23 Expression de protéines recombinantes et purification sur Ni-NTA agarose 25 Electrophorèse de protéines en gel d’acrylamide par la technique SDS-PAGE 27 Electro-transfert de protéines sur membrane de cellulose 31 Western blot 32 Enzyme Linked-ImmunoSorbent Assay (ELISA) 34 Mesure

…………………………… 1) Introduction et rappels des lois de la génétique …………………………………… 2) Extraction d’ADN consiste à obtenir de l’ADN génomique ……………………… 3) Réaction en chaine par polymérase (PCR) ………………………………………… 4) Électrophorèses d’ADN sur gel d agarose …………………………………… 5) Résultats et interprétation …………………………………………………………. III. Conclusion ……………………………………………………. Annexe …………………………………………………………….. Sommaire annexes Annexe 1 : organigramme……………………………………………………………………………….. Annexe 2 : Amplification

3’=>5’ exonucléase, va faire une translation, impression que la coupure avance. Migration éléctrophorétique sur gel C’est la migration sur gel des ADN ou ARN, après introduction d’un champ électromagnétique. On le fait sur deux types de gels : AGAROSE : séparation de 100 à 50 000 nucléotides, polymérisation par refroidissement. POLYACRYLAMIDE : polymérisation par des catalyseurs, séparation de fragments inférieurs à 1000 nucléotides. Il a une meilleure résolution. Il y a deux conditions

conformation des molécules d'ADN, la concentration du gel en agarose et l'intensité du courant qui traverse le gel. Les molécules d'ADN sont ensuite visualisées par un composé fluorescent, le GelRed qui s'intercale entre les bases des molécules d'ADN.REALISATION DU GELTampon de migration : Tris-Acétate-EDTA (TAE) 0,5x. Pour le préparer, diluer avec de l'eau déminéralisée la solution mère concentrée qui vous est fournie. Gel d'agarose : agarose 0.7 % en TAE 0.5x· Peser 350 mg d'agarose SIGMA dans un Erlen